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动物实验室

作者:admin   发布时间:2019-04-26 15:18   点击次数:
一丶动物实验室(大项)
1.DNA与RNA
2.蛋白质与免疫检测
3.细胞与信号通路
4.组织学
5.代谢与生化分析
二丶各项后面的小项
1. DNA与RNA:
载体构建服务
RNA体外转录
mRNA实时荧光定量PCR
慢病毒包装
2.蛋白质与免疫检测:
 免疫印迹
 免疫共沉淀
 蛋白表达与纯化
 抗体制备
3.细胞与信号通路:
 细胞培养和转染
 细胞增殖/凋亡
 细胞迁移/侵袭
荧光素酶活性分析
4.组织学(直接写以下内容):
抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性,免疫组织化学利用特异性的抗体探测组织或细胞中的抗原。由于抗原与抗体的复合物是无色的,因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来,以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性,定位或定量的研究。
免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)利用抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质),对其进行定位、定性的研究。
可提供免疫组织化学(IHC)、免疫细胞化学(ICC)、免疫荧光(IF)等组织形态学方面的实验。

TUNEL检测

常用的细胞凋亡检测方法多样,包括流式细胞法、Annexin V法、DNA片断化检测、TUNEL法、Caspase-3活性的检测等,其中Tunel法检测准确率高,实验周期短,为实验室最常用的检测方法。
基因组DNA断裂时,会激活一些内切酶,这些内切酶将基因组DNA切断为180-200bp的DNA ladder。基因组DNA断裂时,暴露的3’-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT) 的催化下将脱氧核糖核苷酸和荧光素或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端 ,从而可以通过显微镜或流式细胞仪进行检测,这就是TUNEL (TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling) 法检测细胞凋亡的原理。

5. 代谢与生化分析:
液相色谱
气相色谱
质谱
三丶各个小项的单页介绍内容
1.载体构建服务
电话致电→沟通方案→签订协议→样品评估反馈→项目实施→提交报告

2.RNA体外转录(空白页)
3.mRNA实时荧光定量PCR
1. 设计并合成Realtime PCR引物
2. 引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶进行含SG(SYBR® Green)的PCR反应的优化。
3. RNA抽提
    a. 若实验对象为组织样品,取适量(50-100mg)新鲜组织样品或正确保存的组织样品,加1ml的RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen),匀浆后抽提RNA。
    b. 若实验对象为细胞样品,每份样品取1×106~1×107细胞,完全吸去培养液后加1ml的RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen),裂解后抽提RNA。
4. RNA质量检测
    a. 紫外吸收测定法测定RNA在分光光度计260nm和280nm处的吸收值,以计算其浓度并评估RNA纯度。
    b. 使用甲醛电泳试剂(ambion)进行变性琼脂糖凝胶电泳,检测RNA纯度及完整性。
5. cDNA合成
     按照逆转录酶(Invitrogen或Promega)5. 使用说明将样品RNA逆转录为cDNA。
6. 制备标准曲线样品(可选)
    进行相对定量,需要先将样品的目的基因以及管家基因进行PCR扩增, 其产物进行梯度稀释用于做标准曲线。
7. 实时定量PCR
     标准曲线样品和待测样品分别加入到含SG的RealTime PCR反应液中(其中TaqBead热启动聚合酶来自Promega公司),进行RealTime PCR扩增和检测
8. 数据分析
    检测结果进行标准曲线分析,以对待测样品的目的基因进行定量。相对定量实验需要进一步用样品的目的基因测得值除以管家基因测得值以校正误差,所得结果代表某样品的目的基因相对含量。
9. 提供实验报告:包括详细的实验方法及实时荧光定量PCR实验结果及相关图表。

4.慢病毒包装
慢病毒载体构建的基本原理是保留顺式作用元件,去除反式作用元件。
以HIV-1为基础的慢病毒载体系统由两部分组成,即核心载体成分和包装成分。包装成分由HIV-1基因组去除了包装、逆转录和整合所需要的顺式作用元件而构建,它能够反式提供产生病毒颗粒所必须的蛋白;载体成分则与包装成分互补,即含有包装、逆转录和整合所需的HIV-1顺式作用序列,同时具有异源启动子控制下的多克隆位点即在此位点插入的目的基因。为降低两种成分同源重组恢复成野生型病毒的可能,需尽量减少二者的同源性。包装成分一般情况下被分开构建到两个或三个质粒上,其目的也是降低恢复成野生型病毒的可能。将包装成分与载体成分的三个/四个质粒共同转染包装细胞后,经过超速离心即可在上清中获得只有一次性感染能力且无复制能力的、携带目的基因的HIV-1载体。
慢病毒载体的安全性
现在使用的慢病毒载体为自身失活慢病毒载体(SIN)。SIN 慢病毒载体去除了载体3’端长末端重复序列(LTR) 中的U3 区增强子和启动子序列,这使得在逆转录过程中形成的子代载体5’LTR 缺少增强子和启动子序列,因而即使在所有病毒蛋白都存在的情况下也不能转录RNA,一定程度上提高了载体的安全性。

5.免疫印迹
疫印迹(Western Blot,WB)采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对样品中的蛋白质按照分子量进行分离,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜,NC)上。固相载体可以吸附蛋白质,并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的NC膜就称为一个印迹(blot),用蛋白溶液(如5%BSA或脱脂奶粉溶液)封闭处理,封闭NC膜上的非特异结合位点。用目标蛋白的抗体(一抗)孵育NC膜,只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物,这样清洗除去未结合的一抗后,只有在目标蛋白上结合一抗。用一抗处理过的NC膜再用标记的二抗孵育,带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置,即是待研究的蛋白质的位置,并根据显色或发光的强度进行定量。
6. 免疫共沉淀
免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法,是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。 其原理是:当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x,那么与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来,抗体、抗原、以及与抗原具有相互作用的蛋白质通过抗原与抗体之间免疫沉淀反应将形成免疫复合物,经过纯化,洗脱,收集免疫复合物,SDS-PAGE电泳,western blot和(或)质谱可鉴定出与抗原相互作用的蛋白质。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合;也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

7. 蛋白表达与纯化
大肠杆菌蛋白表达系统是最长用也是经济实惠的原核蛋白表达系统。大肠杆菌蛋白表达系统主要具有以下特点:遗传背景清楚、易于培养和控制、转化操作简单、表达水平高、成本低、周期短、抗污染能力强、应用范围广泛等,是大部分科研工作者首选的表达系统。缺点主要是蛋白质翻译后缺乏加工机制,如二硫键的形成、蛋白糖基化和正确折叠。
针对于有些外源基因在大肠杆菌中重组表达会形成膜包裹的高密度、不溶性蛋白质的包涵体的情况,可以进行表达系统优化,尽量降低形成包涵体的几率。
可以提供His、GST、STREP、sumo、MBP等标签的特色融合蛋白的表达,His及STREP标签由6-8个氨基酸组成,对重组蛋白活性影响较小,GST、sumo、MBP标签可以促进目的蛋白的融合表达。目的蛋白在宿主细胞中可以进行低温诱导表达,大大提高了蛋白可溶表达的几率,增加了表达成功率和蛋白产物的活性概率。
8. 抗体制备(空白页)
9. 细胞培养和转染
细胞培养是指细胞在体外条件下的生长,可直接观察活细胞的形态结构和生命活动。用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究,其特点是能够提供大量生物性状相似的实验对象,比较经济。
体外培养的细胞根据增殖能力分为两大类,一类是可以无限增殖的肿瘤细胞系,一类是从机体取出后立即培养的细胞(原代细胞),这类细胞的增值能力很有限。培养细胞的条件非常严格,需要独立的培养细胞间,无菌的37℃恒温培养箱,整个培养过程需要在超净台中操作,严格保持无菌环境。
细胞培养基是人工模拟细胞在体内生长的营养环境,是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。基础细胞培养基主要包括199、MEM、RPMI-1640、DMEM 、DMEM/F12等。主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。人工合成培养基使用时还需添加一定量的小牛或胎牛血清使细胞生长和繁殖。不同的细胞需要不同的培养基,并且培养基的pH、渗透压、血清的添加浓度等因素对细胞培养也至关重要。

拥有健康的细胞才能做出可靠的实验,本公司具有非常熟练的细胞培养技术,可以提供细胞培养方面们各类专业建议!

细胞转染是指将外源分子如DNA,RNA等导入真核细胞的技术。是目前在研究基因功能实验中应用最广泛的技术,是最有效、最快速也是最经济的方法。一般转染的外源分子有各种质粒,设计合成的siRNA片段和miRNA的模拟片段或抑制片段。

转染的方法大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类。物理方法包括:电穿孔法和显微注射法;化学介导方法很多,如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术;生物介导方法,有较为原始的原生质体转染,和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。

理想细胞转染方法,应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。但无论采用哪种转染技术,要获得最优的转染结果,可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多,从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态,到转染方法的操作细节,再到转染的试剂浓度,转染时间等都需要仔细考虑。

我们可以根据您的实验方案提供整套细胞培养及转染方案,包括质粒构建、siRNA设计、最合适的转染方法及最优化的转染条件等具体内容。

10 细胞增殖/凋亡
实验内容:

1、用marker笔在6孔板背后,均匀地划横线,间距0.5~1cm。
2、在空中加入约5X10^5个细胞,具体数量因细胞而异,过夜能铺满即可。
3、第二天用枪头垂直于背后的横线划痕,枪头竖直直。
4、用PBS洗细胞3次,去除划下的细胞,加入无血清培养基。
5、放入37℃5%CO2培养箱培养。按0、6、12、24小时取样,拍照。

实验结果:

1. 细胞计数结果
2. 细胞显微照片
3. 实验报告(包括材料、仪器、操作流程、结果)。


11. 细胞迁移/侵袭
实验内容:
1、用marker笔在6孔板背后,均匀地划横线,间距0.5~1cm。
2、在空中加入约5X10^5个细胞,具体数量因细胞而异,过夜能铺满即可。
3、第二天用枪头垂直于背后的横线划痕,枪头竖直直。
4、用PBS洗细胞3次,去除划下的细胞,加入无血清培养基。
5、放入37℃5%CO2培养箱培养。按0、6、12、24小时取样,拍照。

实验结果:

1. 细胞计数结果
2. 细胞显微照片
3. 实验报告(包括材料、仪器、操作流程、结果)。

12荧光素酶活性分析
Luciferase报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin,在luciferin氧化的过程中,会发出生物荧光(bioluminescence)。然后可以通过荧光测定仪也称化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光。荧光素和荧光素酶这一生物发光体系,可以极其灵敏、高效地检测基因的表达。可以检测:①转录因子与目的基因启动子区DNA相互作用;②miRNA与靶基因相互作用。